Development and Evaluation of Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Test for Quantitative and Qualitative Recognition of H5 Subtype of Avian Influenza Viruses

Document Type: Original Articles

Authors

1 Department of Poultry Diseases Research and Diagnosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

2 Development and Evaluation of Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Test for Quantitative and Qualitative Recognition of H5 Subtype of Avian Influenza Viruses

Abstract

Avian influenza viruses (AIV) affect a wide range of birds and mammals, cause severe economic damage to the poultry industry, and pose a serious threat to humans. Highly pathogenic avian influenza viruses (HPAI) H5N1 were first identified in Southeast Asia in 1996 and spread to four continents over the following years. The viruses have caused high mortality in chickens and various bird species and deadly infections in humans. Multiple conventional methods have been so far introduced for the detection and identification of avian influenza viruses. Traditional virus isolation methods are gold standard protocol in AI detection; nonetheless, virus isolation in embryonating chicken eggs (ECE) is not a rapid method for the detection of influenza viruses since it is time-consuming and labor-intensive. Furthermore, the isolation of highly pathogenic viruses, such as H5, needs BSL3 laboratories.  Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RRT-PCR) is a sensitive and specific method for the detection of influenza viruses. The application of these nucleic acid-based techniques has increased our ability to identify and perform influenza virus care programs, especially in surveillance programs. The current study aimed to detect H5 subtype of avian influenza (AI) virus using fast, specific, and sensitive TaqMan RRT-PCR. Notably, single step RRT-PCR was used to prevent possible laboratory contamination. The specificity of this test was evaluated using nucleic acid extracted from several poultry pathogenic microorganisms and negative clinical specimens from AI-uninfected birds. The sensitivity analysis of the RRT-PCR assay was performed using in vitro-transcribed RNA copy and 10-fold serial dilution of standard AI virus with specific titer. The results indicated the high sensitivity of this method and the lowest detectable dilution of this method based on RNA copies and 1:10 serial dilutions of the standard virus was 10 1.9 EID50 /100. 

Keywords


Article Title [French]

Développement et Évaluation d’un Test d'Amplification en Chaîne par Polymérase, Couplée à une Transcription Inverse pour la Reconnaissance Quantitative et Qualitative des Virus de l'influenza Aviaire du Sous-type H5

Abstract [French]

Les virus de l'influenza aviaire (AIV) affectent une large gamme d'espèces d'oiseaux et de mammifères, causant de graves dommages économiques à l'industrie de la volaille et constituant ainsi une grave menace pour l’homme. En 1996, les virus de l'influenza aviaire hautement pathogènes (HPAI) H5N1 ont été identifiés pour la première fois en Asie du Sud-Est et se sont répartis sur les quatre continents au cours des années suivantes. Les virus ont provoqué une mortalité élevée chez les poulets et diverses espèces d'oiseaux et des infections mortelles chez l'homme. Pour la détection et l'identification des virus de l'influenza aviaire, plusieurs méthodes conventionnelles ont jusqu'à présent été utilisées.méthodes conventionnelles ont jusqu'à présent été introduites. Les méthodes traditionnelles d'isolement des virus sont un protocole de référence pour détecter de l'AI. Les méthodes traditionnelles d'isolement des virus représentent le protocole de référence pour détecterces virus. Cependant, l'isolement du virus à partir des œufs de poule embryonnésreste une méthode laborieuse et consommatrice en temps. De plus, l'isolement des virus hautement pathogènes (H5), nécessite des laboratoires BSL3. Le test d'amplification en chaîne par polymérase, couplée à une transcription inverse (RT-PCR) en temps réel est une méthode sensible et spécifique de détection des virus de l'influenza. L'application de ces techniques à base d'acide nucléique a augmenté notre capacité à identifier et à exécuter des programmes de soins pour des virus de l'influenza, en particulier dans les programmes de surveillance. La présente étude visait à détecter des virus de l'influenza aviaire du sous-type H5 à l'aide d'une RT-PCR TaqMan qui permet une étude rapide, sensible et spécifique. Notamment, pour prévenir les cas de contamination en laboratoire, la mise en place d’une procédure de PCR en une seule étape a été privilégiée. La spécificité de ce test a été évaluée à l'aide d'acide nucléique extrait de plusieurs micro-organismes pathogènes de volaille et des échantillons cliniques négatifs provenant d'oiseaux non infectés par l'AI. L'analyse de sensibilité du test RT-PCR a été réalisée en utilisant une copie d'ARN transcrit in vitro et une dilution en série de 10 fois du virus AI standard avec un titre spécifique. Les résultats ont démontré la sensibilité élevée de cette méthode et une capacité de détecter desconcentrations très faibles d'ARN dansles dilutions en série 1:10 du virus standard (jusqu’à 10 1.9 EID50 /100).

Keywords [French]

  • H5
  • Virus de L'influenza Aviaire
  • PCR en Temps Réel
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