Development of a Lateral Flow Immunoassay Using Recombinant Dense Granular Antigen (GRA) 7 to Detect Anti-Toxoplasma gondii IgG Antibodies

Document Type: Original Articles

Authors

1 Department of Parasitology and Mycology, Faculty Medicin, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran

2 Department of Quality Control, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization, Karaj, Iran

3 Department of Microbiology and Immunology, Islamic Azad University, Tehran Medical Branch, Tehran, Iran

4 Biosensor Research Center, Endocrinology and Metabolism Molecular-Cellular Sciences Institute, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

5 Infectious Diseases and Tropical Medicine Research Center, Shahid Beheshti University of Medial Sciences, Tehran, Iran

6 Department of Technical and Research Lab, Arvin Pazhoohan Noor (APN), Tehran, Iran

Abstract

Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite that causes toxoplasmosis and is of medical importance in pregnant women and immunosuppressed patients. In recent years, many methods have been developed for the detection of infection caused by this parasite; however, most of the developed methods are not adequately sensitive. The dense granular antigen (GRA) 7 is a highly immunogenic protein that is used as a specific antigen for the diagnosis of toxoplasmosis. This study was designed to produce recombinant GRA7 (rGRA7) antigen in bacterial system in order to be applied as an antigen for developing a simple and rapid lateral flow immunoassay test strip using a gold nanoparticle-pAb conjugate probe to detect Toxoplasma IgG-specific antibodies in human sera. After the extraction of genomic DNA from RH strain tachyzoites, polymerase chain reaction (PCR) was performed using specific primers considering restriction sites and BglII and XhoI enzymes. Subsequently, the GRA7 gene was cloned in pET-32a (+) expression vector, and then pET-32a(+)-GRA7 was transformed into E. coli Rosetta (DE3). The induction of protein production was accomplished by IPTG, and the product was finally purified by Ni-NTA affinity chromatography. In order to make the strip test, the anti-human gold nanoparticle conjugate was applied on conjugate pad, rGRA7 antigen was immobilized to a nitrocellulose membrane as the capture agent, and sample and absorbance pads were assembled on a backing card. For the analysis of the sensitivity and specificity of the assay, the selected patients’ sera samples were tested by standard chemiluminescence immunoassay (CLIA) method, and then compared with TOXO-IgG strip results. The findings showed that the use of rGRA7 is an accurate, sensitive, and inexpensive technique for the rapid detection of anti-Toxo­plasma IgG in human sera. Therefore, rGRA7 can be applied as a diagnostic agent in laboratories.

Keywords

Main Subjects


Article Title [French]

Développement d'un Dosage Immunologique à Flux Latéral Utilisant l'Antigène GRA7 Recombinant pour Détecter les Anticorps IgG Anti-Toxoplasma gondii

Abstract [French]

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire responsable de la toxoplasmose avecune importance médicale pour les femmes enceintes et les patients immunodéprimés. Ces dernières années, de nombreuses méthodes ont été développées pour la détection des infections causées par ce parasite. Cependant, la plupart des méthodes développées ne sont pas suffisamment sensibles. La protéine antigène granulaire 7 (GRA7) est une protéine hautement immunogène utilisée comme antigène spécifique pour le diagnostic de la toxoplasmose. Cette étude a été conçue pour produire un antigène GRA7 (rGRA7) recombinant dans un système bactérien afin de l’appliquer en tant qu’antigène dans ledéveloppement d’une bandelette de test simple et rapide d’immunoessai à écoulement latéral à l’aide d’anticorps conjugués à des nanoparticules d’or (nanoparticle-pAb) afin de détecter les anticorps IgG spécifiques du Toxoplasma dans des sérums humains. Après l'extraction de l'ADN génomique des tachyzoïtes de la souche RH, une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) a été effectuée à l'aide d'amorces spécifiques, tout en tenant compte des sites de restriction et des enzymes BglII et XhoI. Ensuite, le gène GRA7 a été cloné dans le vecteur d'expression pET-32a (+), puis le pET-32a(+)-GRA7 a été transformé en Rosetta (DE3). La production de protéines recombinantes a été induite par l'isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside et purifiée par chromatographie d'affinité Ni-NTA. Afin de réaliser le test de bande, le conjugué anti-IgG humain etnanoparticules d'or a été a été ajouté à un tampon conjugué. L'antigène rGRA7 a été ensuite immobilisé sur une membrane de nitrocellulose en tant qu'agent de capture et des tampons d'échantillon et d'absorbance ont été assemblés sur une carte support. Pour l’analyse de la sensibilité et de la spécificité de l’analyse, les échantillons de sérum des patients sélectionnés ont été testés par la méthode standard d'immunoessai par chimiluminescence (CLIA), puis comparés aux résultats obtenus avec les bandelettes TOXO-IgG. Les résultats ont montré que l'utilisation de rGRA7 était une technique précise, sensible et peu coûteuse pour la détection rapide d'IgG anti-Toxoplasma dans des sérums humains.De ce fait, rGRA7 peut être utilisé comme agent de diagnostic dans les laboratoires.

Keywords [French]

  • Toxoplasma gondii
  • rGRA7
  • Rosetta (DE3)
  • pET-32a(+)
  • Dosage immunologique à flux latéral (LFA)
Arab-Mazar, Z., Fallahi, S., Koochaki, A., Haghighi, A., Seyyed Tabaei, S.J., 2016. Immunodiagnosis and molecular validation of Toxoplasma gondii-recombinant dense granular (GRA) 7 protein for the detection of toxoplasmosis in patients with cancer. Microbiol Res 183, 53-59.

Drapala, D., Holec-Gasior, L., Kur, J., Ferra, B., Hiszczynska-Sawicka, E., Lautenbach, D., 2014. A new human IgG avidity test, using mixtures of recombinant antigens (rROP1, rSAG2, rGRA6), for the diagnosis of difficult-to-identify phases of toxoplasmosis. Diagn Microbiol Infect Dis 79, 342-346.

Dunn, J.D., Ravindran, S., Kim, S.K., Boothroyd, J.C., 2008. The Toxoplasma gondii dense granule protein GRA7 is phosphorylated upon invasion and forms an unexpected association with the rhoptry proteins ROP2 and ROP4. Infect Immun 76, 5853-5861.

Gholamzad, M., Khatami, M.R., Ghassemi, S., Vaise Malekshahi, Z., Shooshtari, M.B., 2015. Detection of Staphylococcus Enterotoxin B (SEB) Using an Immunochromatographic Test Strip. Jundishapur J Microbiol 8, e26793.

Goudarzi, S., Ahmadi, A., Farhadi, M., Kamrava, S.K., Mobarrez, F., Omidfar, K., 2015. A new gold nanoparticle based rapid immunochromatographic assay for screening EBV-VCA specific IgA in nasopharyngeal carcinomas. J Appl Biomed 13, 123-129.

Hiszczyńska-Sawicka, E.b., Brillowska-Dąbrowska, A., Dąbrowski, S., Pietkiewicz, H., Myjak, P., Kur, J., 2003. High yield expression and single-step purification of Toxoplasma gondii SAG1, GRA1, and GRA7 antigens in Escherichia coli. Protein Expr Purif 27, 150-157.

Holec-Gasior, L., 2013. Toxoplasma gondii recombinant antigens as tools for serodiagnosis of human toxoplasmosis: current status of studies. Clin Vaccine Immunol 20, 1343-1351.

Jongert, E., de Craeye, S., Dewit, J., Huygen, K., 2007. GRA7 provides protective immunity in cocktail DNA vaccines against Toxoplasma gondii. Parasite Immunol 29, 445-453.

Kotresha, D., Noordin, R., 2010. Recombinant proteins in the diagnosis of toxoplasmosis. Apmis 118, 529-542.

Mahmood, T., Yang, P.C., 2012. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci 4, 429-434.

Marcolino, P.T., Silva, D.A., Leser, P.G., Camargo, M.E., Mineo, J.R., 2000. Molecular markers in acute and chronic phases of human toxoplasmosis: determination of immunoglobulin G avidity by Western blotting. Clin Diagn Lab Immunol 7, 384-389.

Pfrepper, K.I., Enders, G., Gohl, M., Krczal, D., Hlobil, H., Wassenberg, D., et al., 2005. Seroreactivity to and avidity for recombinant antigens in toxoplasmosis. Clin Diagn Lab Immunol 12, 977-982.

Silva, N.M., Lourenco, E.V., Silva, D.A., Mineo, J.R., 2002. Optimisation of cut-off titres in Toxoplasma gondii specific ELISA and IFAT in dog sera using immunoreactivity to
SAG-1 antigen as a molecular marker of infection. Vet J 163, 94-98.